140 лет тому назад была открыта ДНК. Это открытие стало основой для многих инновационных направлений биотехнологии, молекулярной биологии и медицинской науки. Не стала исключением и репродуктивная медицина. В настоящее время ДНК-анализ широко используется для установления отцовства и материнства, выявления наследственных заболеваний и нарушений развития. Последние достижения в области генетического анализа позволяют проводить эти исследования не только после рождения ребенка, но еще на стадии эмбрионального развития. О современных возможностях пренатального ДНК-анализа читайте в статье нашего британского коллеги.

Немного истории

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) была открыта в 1869 году швейцарским ученым Иоганном Фридрихом Мишером (Johannes Friedrich Miescher). На протяжении многих лет биологическая функция ДНК была не ясна. Даже в начале ХХ столетия, когда генетика уже сформировалась как отдельная наука, многие ученые были уверены, что ДНК не имеет никакого отношения к передаче наследственной информации (тогда было принято мнение, что эту функцию выполняют белки).

Прошло не одно десятилетие, прежде чем в 40-х годах ХХ века ученые доказали, что именно ДНК является носителем генетической информации. В 1953 году англичанин Френсис Крик (Francis Crick) вместе с американцем Джеймсом Уотсоном (James Watson) установили, что структура ДНК представляет собой двойную антипараллельную спираль, тем самым положив начало современной молекулярной биологии, что по праву считается самым главным открытием в биологии прошлого века. Эта работа была удостоена Нобелевской премии по физиологии и медицине 1962 года.

Возможность использования ДНК для идентификации человека впервые была предложена в начале 80-х годов ХХ века профессором Лестерского университета Великобритании — Алеком Джеффрисом (Alec Jeffreys), который обнаружил, что несмотря на то, что ДНК всех людей более чем на 99% идентична, в ней существуют такие участки, которые отличаются от человека к человеку. Этими участками являются повторяющиеся последовательности ДНК так называемые мини- и микросателлиты. В настоящее время ДНК-анализ используют не только для установления отцовства и других видов родства, но также в криминалистике, где этот метод стал основным методом идентификации человека.

Сегодня для анализа родственных отношений или же для идетнификации личности по ДНК применяют микросателлитные генетические маркеры — STR (Simple Tandem Repeats — простые тандемные повторы). Этот тип маркеров представляет собой нуклеотидные повторы (например, ACTG, или GTAA), происходящие определенное количество раз. Анализируя небольшое количество разных типов повторов (называемых ДНК-маркерами) в генотипе человека можно получить его уникальный генетический профиль, который используется для анализа в целях установления родства. В настоящее время установление отцовства и других видов родства в основном проводят по 16 аутосомным STR-маркерам, но уже существуют системы с большим количеством ДНК-маркеров. На автоматических генетических анализаторах при помощи капиллярного электрофореза анализируют STR-маркеры, хотя иногда еще встречаются лаборатории (особенно на территории бывшего СССР, в частности в Украине), которые используют морально устаревшую технологию пластинчатого электрофореза с визуализацией маркеров при помощи радиоактивной метки или окраски нитратом серебра. Наиболее распространенными системами анализа аутосомных STR-маркеров являются AmpflSTR Identifiler (Applied Biosystems, США) и PowerPlex-16 (Promega Corp., США). Точность анализа составляет 100% при исключении и 99,99% и выше при неисключении отцовства.

В 90-х годах прошлого века учеными был открыт новый вид ДНК-маркеров, называемый SNP (Single Nucleotide Polymorphism — единичный нуклеотидный полиморфизм). Как следует из названия, SNP представляют собой единичные различия в цепочке ДНК между людьми (например, вместо AACTGT будет AATTGT). Это наиболее распространенный тип ДНК-маркеров в геноме человека. Если количество STR-маркеров составляет около 10 000 (а количество STR-маркеров пригодных для идентификации человека не более 2000), то на 2010 год количество иднетифицированных SNP-маркеров достигло 10 000 000. Из-за своей природы SNP-маркеры менее информативны чем STR-маркеры, но уже существует технология, позволяющая их успешно использовать вместо STR-маркеров для установления родства и идентификации человека. При помощи нескольких молекулярно-биологических технологий анализируют SNP-маркеры. Наиболее распространенной на сегодняшний день является полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени с использованием TaqMan-зондов, «молекулярных буев», или же «скорпионов». Крупные лаборатории также используют технологии на основе масс- спектрометрии (MALDI-TOF), или же SNPStream, которые, в отличие ПЦР в реальном времени, повзоляют одновременно анализировать десятки SNP-маркеров в одной реакции.

Пренатальный анализ ДНК

Существует три основных метода пренатального анализа ДНК. Они отличаются способом взятия биологического материала у плода:

1. Биопсия хориона (анализ хорионных волосков) — проводится на 9–12 неделях беременности.
2. Амниоцентез — проводится на 13–17 неделях беременности.
3. Анализ периферической или венозной крови матери — проводится начиная с 7-й недели после зачатия.

Первые два метода являются инвазивными и несут в себе до 3% риска прерывания беременности или причинения вреда плоду и здоровью матери. Полученные этими способами биологические образцы плода могут быть использованы как для стандартного анализа ДНК на отцовство (и другие виды родства), так и для определения пола будущего ребенка и наличия генетических аномалий. Технология анализа ДНК в этих случаях не отличается от обычной постнатальной технологии. Для установления отцовства полученные образцы плода анализируются по 16 STR-маркерам и результаты сравниваются с ДНК-профилями биологической матери и предполагаемого отца (анализ биологической матери в данном случае обязателен, т.к. образцы плода всегда загрязнены биологическим материалом матери). Точность таких анализов в большинстве случаев не отличается от аналогичной при постнатальном анализе.

В отличие от вышеуказанных, анализ периферической или венозной крови является самым безопасным методом взятия образцов для исследований. Мать и плод имеют общую кровеносную систему. Несколько лет назад было убедительно показано, что в периферической (и венозной) крови матери присутствует ДНК плода, причем имеющаяся на сегодняшний день технология позволяет получать достоверные результаты анализа этой ДНК уже начиная с 7-й недели после зачатия. Этот феномен положен в основу неинвазивного пренатального определения отцовства, а также определения пола будущего ребенка.

Если для постнатального анализа ДНК в целях установления отцовства (или для пренатального анализа ДНК, когда образцы получены в результаты биопсии хориона, или амнеоцентеза) используются STR-маркеры, определение отцовства по крови беременной женщины проводят путем анализа SNP-маркеров.

Имеющаяся на вооружении ученых технология позволяет быстро и надежно аналазировать сотни SNP-маркеров и сравнивать полученные результаты с результатами биологической матери и предполагаемого отца. Если женщина беременна мужским плодом, то анализируются маркеры, присутствующие на Y-хромосоме, которая передается только от отца к сыну. Если же плод женский, то анализируются SNP-маркеры на X-хромосоме (у девочек две X-хромосомы, одна из которых получена от отца) и еще на одной хромосоме, как правило, хромосоме 1, которая является самой большой в геноме человека. Точность таких анализов не уступает стандартному анализу по STR-маркерам.

Возможность детектирования ДНК плода в кровеносной системе матери также лежит в основе пренатального определение пола будущего ребенка по крови матери. Этот метод основан на анализе ДНК, выделенной из материнской крови по SNP-маркерам, специфичным Y-хромосоме. Отсутствие данных маркеров в образцах свидетельствует о том, что плод женский (или в случае множественной беременности все эмбрионы женского пола). Если же эти маркеры обнаружены, значит женщина беременна мальчиком (или в случае множественной беременности как минимум один эмбрион будет мужского пола). В настоящее время широкой популярностью пользуется коммерческий тест Pink or Blue, проводимый нашей лабораторией в сотрудничестве с американскими партнерами, который позволяет определить пол будущего ребенка по периферической крови матери начиная с 7-й недели после зачатия. Точность этого анализа составляет 95%, что намного превышает аналогичные неинвазивные методы (например, УЗИ, где точность определения пола плода на аналогичных скроках составляет около 80%).

Факторы, влияющие на точность пренатального анализа ДНК

Основной проблемой при анализе образцов плода, полученных при биопсии хориона или амниоцентезе, являетя загрязнение биологическим материалом матери. В некоторых случаях такое загрязнение может существенно затруднить интерпретацию результатов анализов. Поэтому при проведении исследований обязательным является анализ ДНК матери, наряду с анализом ДНК предполагаемого отца и плода.

При проведении анализа ДНК плода по периферической (или венозной) крови матери образцы ДНК плода по определению будут загрязнены ДНК матери и на точность анализа влияют факторы другого порядка.

Считается, что кровь человека обновляется полностью в среднем за 3 месяца, однако даже после истечении этого срока в обновленной крови могут присутствовать клетки и ДНК «старой» крови. Недавнее переливание донорской крови, недавняя беременность (или выкидыш) могут повиять на результаты анализа, т.к. невозможно будет определить анализируется ли ДНК настоящего либо предыдущего плода или же ДНК донора крови. Если женщине была проведена пересадка костного мозга или органа, то проводить анализ на дородовое определение пола ребенка или же на отцовство по крови матери не рекомендуется.

Важным фактором, влияющим на результаты анализа, является срок отбора образцов периферической (или венозной) крови у матери. На первых неделях беременности в крови матери может быть недостаточно генетического материала плода, поэтому анализы рекомендуется проводить начиная с 7-й недели после зачатия, когда количество ДНК плода в крови матери считается достаточным для проведения исследований. 

Кроме этих факторов существует еще ряд факторов, которые могут повлиять на точность результатов анализа ДНК плода по крови матери. Основными из них являются естественный низкий уровень зародышевой ДНК в крови матери, который имеют около 3% всех беременных женщин, а также «исчезнувший близнец» (В некоторых случаях беременность начинается как множественная, но на ранних стадиях один из зародышей отмирает. ДНК такого «исчезнувшего» близнеца может повлиять на результаты анализа.)

Тем не менее, несмотря на вышеперечисленные факторы неинвазивные пренатальные методы ДНК-анализа являютя мощным инструментов в руках генетика-репродукциониста, которые позволяют приоткрыть завесу тайны: каким же будет пол вашего ребенка.

Источник: Журнал "МЕДИЦИНСКАЯ ПРАКТИКА: организационные и правовые аспекты", № 5, 2010